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高質(zhì)量熒光成像小技巧
來源:客戶案例    發(fā)布時間:2023/4/21 14:11:03

不想實驗白忙活?高質(zhì)量熒光成像小技巧學起來


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熒光染色是個麻煩的工作流程,辛苦染色樣品就為了獲得一張好的熒光圖片,如果成像沒做好、圖片沒拍好,那真的是血虧、白忙活。為什么要用熒光成像?如何用熒光顯微鏡拍攝才能獲得高質(zhì)量的熒光成像?今天我們就來給大家介紹一下。

1

熒光成像:現(xiàn)代實驗室的技術(shù)

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FITC熒光染色的細胞骨架
熒光染色工作流相對明場染色復雜,那為什么要用熒光成像呢?首先回歸基礎概念,熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象,指某些物質(zhì)(如熒光探針)在一定波長激發(fā)光的照射下,在短時間內(nèi)發(fā)出比激發(fā)光波長更長、能量更低可見光的現(xiàn)象。
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FISH熒光原位雜交技術(shù)
熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢,熒光探針可以特定性標記細胞器等目標,非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察,共定位和相互作用的研究,離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等,廣泛應用于細胞生物學、神經(jīng)生物學、植物學、微生物學、病理學、遺傳學等各領(lǐng)域,是現(xiàn)代實驗室標配的檢測方案、成像方案。
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倒置熒光顯微鏡MF52-N
熒光成像一般使用熒光顯微鏡進行,根據(jù)不同的實驗目標,需要選擇不同型態(tài)的熒光顯微鏡,比如切片類樣品或水質(zhì)檢查等高倍觀察適合用正置熒光顯微鏡,培養(yǎng)皿、活細胞類樣品適合用倒置熒光顯微鏡,植物和模式生物等大樣品適合用體視熒光顯微鏡。

2

熒光顯微鏡的兩個核心部件

熒光的產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程,在熒光顯微鏡中具體體現(xiàn)為熒光光源和激發(fā)塊兩個關(guān)鍵部件,已經(jīng)都整個在熒光臂(熒光模塊)中,沒有這兩個部件,熒光無從談起,這兩個部件不合適,熒光效果大打折扣。
(1)激發(fā)光源:主要包含以下兩個指標
  • 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜:熒光探針在特定波段范圍才能被激發(fā),因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光探針的激發(fā)特征。
  • 發(fā)射光譜波段的強度:熒光信號一般較弱,需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強信號的發(fā)射熒光信號。
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新型熒光光源明美四通道光源MG120
(2)激發(fā)塊:用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片,一般包含以下三個
  • 激發(fā)濾光片EX:濾過光源中特定波段的光,用以激發(fā)樣本中特定熒光探針
  • 發(fā)射濾光片EM:允許熒光探針發(fā)射的特定波段的光通過
  • 二向分色鏡DM:反射激發(fā)波段的光,透過發(fā)射波段的光。
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明美可定制適配顯微鏡,不同波段需求的激發(fā)塊

3

成像“寧欠勿曝”是個坑,曝光盡量亮一點

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欠曝的斑馬魚JPG圖片
看完上面的資料,大家應該都對熒光顯微鏡有更好的了解了,下面我們來講成像拍照部分。

現(xiàn)在的熒光成像拍照基本都是用熒光顯微鏡搭配顯微鏡數(shù)字相機進行的,但不少教學資料可能還停留在膠片時代,這些資料可能和數(shù)字相機不太對得上,典型的就是“寧可欠曝,也不要過曝”,簡稱“寧欠勿曝”。舉個例子,上圖是一張JPG格式的欠曝的斑馬魚熒光圖片,看起來有點費眼神。
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后期調(diào)亮的斑馬魚圖,噪聲多且有斷層
通過后期調(diào)整亮度,斑馬魚的信號是增強了,但背景的雜訊和噪點也增強了,看起來很不干凈,色彩也出現(xiàn)了斷層。

膠片相機擅長表現(xiàn)暗部,因此才有“寧欠勿曝”,而顯微鏡數(shù)字相機相反,不擅長表現(xiàn)暗部,如果圖片欠曝,那么有效信號就更可能跟背景噪聲混在一起,從而降低了圖片的信噪比,成像效果就會不理想。因此對于顯微鏡數(shù)字相機來說,樣品信號的曝光盡量亮一點會更好,這可以通過在明美顯微成像系統(tǒng)中增加曝光時間或增益實現(xiàn)。

4

選擇合適的熒光光源和激發(fā)塊

提升信號亮度

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典型熒光光源:汞燈
上面我們介紹過,熒光顯微鏡有兩個核心部件,熒光光源和激發(fā)塊。要提升熒光亮度,除了調(diào)整相機的曝光時間和增益,還要選擇高光強的熒光光源和合適的濾光片組。熒光光源典型代表是高壓汞燈,它可以在特定波長提供非常高的光強,缺點是需要預熱,使用壽命較短,且在壽命用盡之前還會有亮度衰減問題,如果你的汞燈亮度不足,建議先看看ND濾鏡是不是調(diào)錯了,如果ND濾鏡沒錯,那可能就是壽命快到了,要換個燈泡或換掉整個熒光光源。

部分資料可能還將金屬鹵素燈列為熒光光源,雖然鹵素燈能覆蓋激發(fā)光譜,且使用壽命比汞燈更長,但用作熒光光源時光強是不足的,熒光信號弱,不適合用于數(shù)字成像。
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安裝四通道光源MG-120的熒光顯微鏡
現(xiàn)在我們有比汞燈和鹵素燈都要好的熒光光源,LED熒光光源,比如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100和四通道光源MG-120. LED熒光光源能提供接近汞燈的激發(fā)光譜和光強,而且可以即開即用,亮度可以線性調(diào)整,省去了預熱、調(diào)ND濾鏡等一系列流程,使用更加方便,而且壽命還能達到汞燈等幾十倍甚至上百倍。
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明美提供高性價比的激發(fā)塊
激發(fā)塊用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射光譜,如果激發(fā)塊的參數(shù)和熒光探針的參數(shù)不匹配,就會導致樣品熒光信號弱,需要切換到合適的激發(fā)塊解決。另外激發(fā)塊還有個通光效率的參數(shù),一般進口濾光片組的通光效率要比國產(chǎn)濾光片組好幾十個百分比,熒光信號顯著更強,背景更暗,信噪比更高,但對應地成本也會高很多,明美選用進口濾光片組裝熒光激發(fā)塊,在保障良好的激發(fā)效果前提下,有效降低了成本,并且除了BGUYR等常用波段,還有針對結(jié)核檢查的寶藍B2和針對熒光原位雜交FISH的藍綠雙通等特殊配置,大大提升了病理檢查等成像應用的效率。

5

使用高靈敏度相機和色階/曲線

提升信噪比


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高靈敏度相機能獲取高信噪比成像
數(shù)字相機隨著增益值提升和曝光時間的增加,會有不同程度的背景噪聲和熱噪聲問題,使用MC50-S、MSX2等高靈敏度相機可以用更低的曝光時間實現(xiàn)理想的曝光,這不僅更方便拍攝未固定的樣品,還能帶來更高的信噪比,因此熒光成像一般推薦用高靈敏度相機。
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使用色階處理去除背景熒光
熒光成像通常多多少少會有背景熒光問題,使用熒光擋板遮擋明場聚光鏡,能減少落射熒光成像時的背景熒光,而在數(shù)字相機成像時,我們可以通過調(diào)整明美顯微成像系統(tǒng)的色階或者曲線設置,實時壓低或去除背景熒光信號,再拍照。比如色階處理中,我們通常把滑條左下的滑塊往右調(diào),來去除背景熒光信號,然后將中間滑塊往左調(diào),適當補償樣品信號,即可獲得高信噪比的成像。

6

圖片格式用TIFF更保險

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TIF格式樣品圖
在一開始的例子中,我們特別強調(diào)了JPG格式,那是不是用其他格式會更好?還真的是。舉個例子,上圖是一張TIF格式的欠曝樣品圖。
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處理后的樣品圖
通過簡單后期處理,我們還是可以獲得一張能用的樣品圖。這是因為JPG文件格式會將暗部細節(jié)和高光細節(jié)等人眼不善于分辨的內(nèi)容丟掉,來壓縮數(shù)據(jù)量,這里面可能就包含對我們有用的樣品細節(jié),而TIF格式可以儲存未壓縮的原始數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)經(jīng)過處理還是有機會用得上的,這也是論文圖片通常用TIF格式的原因。
明美是國家高新技術(shù)企業(yè),創(chuàng)立至今已20年,專注于顯微鏡以及顯微成像系統(tǒng)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售,致力于顯微成像領(lǐng)域的自動化、數(shù)字化、智能化;明美迄今已為全球10萬+的用戶提供過產(chǎn)品以及服務;明美曾屢獲國家創(chuàng)新基金支持,被廣東省科技廳認定為顯微成像工程技術(shù)研究。

公司以品質(zhì)謀發(fā)展,以服務為宗旨,連續(xù)11年獲守合同重信用企業(yè)認證,已通過ISO9001質(zhì)量管理體系、ISO14001環(huán)境管理體系、ISO13485醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系和知識產(chǎn)權(quán)管理體系認證,擁有二類醫(yī)療器械生產(chǎn)資質(zhì),獲得軟件著作權(quán)。

明美總部位于廣州,在全國20余個大中城市均設有服務網(wǎng)點,提供完善的專業(yè)服務。

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來源:https://www.mshot.com/article/1703.html

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